【綜述】EB病毒相關疾病免疫治療的研究進展！

　　EB病毒(Epstein－Barrvirus，EBV)是屬于人皰疹病毒γ亞科的DNA病毒，可侵襲宿主的B淋巴細胞以及T細胞和NK細胞[1]。EBV感染在全球范圍內(nèi)普遍存在，約90%以上的成年人EBV抗體檢測呈陽性，其主要通過唾液傳播，也可經(jīng)輸血傳染[1]。EBV感染可導致各種淋巴細胞增殖性疾病，包括非腫瘤性增殖性疾病和腫瘤性疾病，前者包括傳染性單核細胞增多癥(infectiousmononucleosis，IM)、慢性活動性EBV感染(chronicactiveEpstein－Barrvirusinfection，CAEBV)、EBV相關噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥(Epstein－Barrvirus－relatedhemophagocyticlymphohistiocytosis，EBV－HLH)；后者包括Burkitt‘s淋巴瘤(Burkitt’slymphoma，BL)、霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma，HL)、非霍奇金淋巴瘤(non－h(huán)odgkinlymphoma，NHL)、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)等，以及免疫缺陷患者感染EBV后多發(fā)的淋巴組織增殖性疾病(lymphoproliferativedisease，LPD)[1，2]。以上EBV相關疾病除IM病死率極低、預后良好外，其他類型疾病多為惡性腫瘤，預后極差、治療困難。傳統(tǒng)的手術、化療、放療對這類惡性腫瘤療效不佳且導致嚴重的不良反應，因此尋找新的治療策略成為當務之急。近年來，隨著對人體免疫系統(tǒng)與EBV之間的相互關系的深入研究，促使免疫療法在治療EBV相關疾病中的廣泛應用。本文將對目前國內(nèi)外針對EBV相關疾病的免疫療法的發(fā)展以及應用現(xiàn)狀進行綜述。

　　一、抗體治療

　　目前，抗人CD20單克隆抗體利妥昔單抗(Rituximab)廣泛用于治療B淋巴細胞相關的LPD，成為治療CD20陽性淋巴瘤的一線用藥，其在移植后EBV相關淋巴增殖性疾病(EBV－LPD)中的療效可達到63%[3]。利妥昔單抗的作用機制主要是通過Fab結構區(qū)與B淋巴細胞上的CD20抗原結合，隨后通過補體－依賴細胞毒性和抗體－依賴細胞介導細胞毒性作用導致B淋巴細胞溶解，因此可以將處于異常增殖的B淋巴細胞，以及被EBV感染的B淋巴細胞從體內(nèi)清除。但它同時也會損傷表達CD20的正常B淋巴細胞；利妥昔單抗對T細胞淋巴瘤以及CD20突變腫瘤的治療效果不佳[3]。另外，經(jīng)利妥昔單抗治療后患者無法恢復正常的免疫功能、出現(xiàn)疾病易復發(fā)和引起致命性病毒感染等情況[3，4]。近年來，CD20單抗丟失的病例在經(jīng)利妥昔單抗治療后多有報道，其中涉及的機制包括細胞內(nèi)吞(internalization)和胞啃(trogocytosis)作用[5，6]。CD20單抗丟失可能也是利妥昔單抗在一些患者中出現(xiàn)療效不理想以及導致病情反復的重要潛在因素之一[6，7]。

　　一種新的經(jīng)糖化修飾后的人源化抗CD20單克隆抗體Obinutuzumab，最近已完成相關的動物實驗和臨床Ⅰ或Ⅱ期研究，顯示出比利妥昔單抗更強的抗腫瘤活性，且耐受性良好[8，9]。另外，人源化抗CD52單抗(Alemtuzumab，阿侖單抗)和人源化抗CD22單抗(Epratuzumab，依帕珠單抗)的有效性在一些小規(guī)模研究和個案報道中亦得到證實，如針對利妥昔單抗耐藥、復發(fā)難治的彌散性大B細胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)[10，11]。

　　二、造血干細胞移植

　　移植非親屬的臍帶造血干細胞，已有成功治療CAEBV的病例報道，適用于對化療敏感或者無合適HLA配型的骨髓干細胞移植的患者[12，13]。同種基因外周血或骨髓干細胞移植可作為先天性免疫缺陷綜合征的患者的最終治療方案。近年來，造血干細胞移植可有效降低患者體內(nèi)的病毒載量、建立正常的抗EBV免疫反應，目前被認為是有可能治愈CAEBV的有效策略之一[14]。EBV－HLH的患兒血清中EBV復制水平顯著高于EBV感染引起的IM患兒，所以在治療EBV－HLH的患兒時應用HLH－94方案或HLH－2004方案的同時，需要進行抗病毒治療。有條件可進行干細胞移植或免疫治療[15，16]。

　　三、細胞免疫治療

　　病毒相關抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)在保護機體免受病毒感染，以及殺傷和清除受病毒感染的宿主細胞、病毒誘導細胞惡性轉化的過程中發(fā)揮至關重要的作用。因此通過過繼輸注來自異體或者自體的淋巴細胞，在短時間內(nèi)重建或者修復患者體內(nèi)特異性免疫應答能力已成為一種新的且行之有效的抗病毒及病毒相關腫瘤的治療方案[17]。目前常用獲取特異性CTL的途徑包括：從供者外周血單個核細胞中直接分選特異性CTL、在體外直接誘導制備特異性CTL以及建立第三方CTL庫。

　　1．供者淋巴細胞輸注(donorlymphocyteinfusions，DLI)：

　　由于約90%的人都攜帶有EBV，因此在大部分人外周血單個核細胞中都存在EBV特異性CTL。將EBV血清反應為陽性的供者來源的病毒特異性淋巴細胞分離后，直接輸注給患者是治療EBV感染相關疾病的有效方法[18]。但是，由于DLI移植物中含有大量的異體反應性T淋巴細胞會引發(fā)嚴重乃至致命的移植物抗宿主病(graftversushostdisease，GVHD)，這種治療手段在臨床上已逐漸被其他方法所取代[18]。由于妊娠時期母親和胎兒間的雙向血流交換，可以在母親和孩子體內(nèi)長期形成母子微嵌合體(fetal－maternalmicrochimerism)可能誘導母子特異的免疫耐受。最近，有報道應用大劑量HLA半相合的，來源于母親的淋巴細胞治療5例患有EBV相關T淋巴細胞增殖癥的患兒。接受細胞過繼輸注1周后，3例患兒臨床癥狀明顯緩解，2例患兒的癥狀得到部分緩解，且無1例發(fā)生明顯的GVHD[19]。

　　2．EBV特異性CTL輸注：

　　為制備大量EBV特異性CTL用于治療患者，目前常用類淋巴母樣細胞系(lymphoblastoidcellline，LCL)作為抗原提呈細胞在體外誘導擴增EBV特異性CTL的產(chǎn)生[17]。Heslop等[20]使用該方法制備EBV－CTL用于預防和治療EBV相關的淋巴細胞增殖癥，并對該治療方案的長期性、有效性以及安全性進行了全面的評估。在101例接受預防性治療的患者中，無一例發(fā)生LPD；13例接受治療性輸注的患者中，11例達到完全緩解，在所有全部接受治療的患者中無GVHD個案的發(fā)生。更為重要的是，對比嵌合抗原T細胞(chimericantigenreceptorTcells，CART)治療方案，EBV－CTL輸注不會導致“細胞因子風暴”(cytokinestorm)的產(chǎn)生[21]。經(jīng)過近十年來的臨床試驗，使用LCL制備的EBV－CTL具有良好的治療效果和安全性，目前已成為經(jīng)典的制備EBV－CTL方法。但這種方法也有其局限性，例如產(chǎn)生的特異性CTL主要是針對Ⅲ型潛伏感染相關的惡性疾病。另外，制備的流程較為復雜，制備時間過長(約10周)。因此，針對性的改造LCL，使其表達潛伏膜蛋白(LMP)等非優(yōu)勢抗原表位，或者利用其他經(jīng)過基因工程改造的細胞，如K562細胞，制備特異性的EBV－CTL，進而治療Ⅱ型潛伏感染相關的惡性疾病，如NPC和HL[21]。例如，Bollard等[22]用過表達LMP蛋白的LCL制備獲得的EBV－CTL治療Ⅱ型潛伏感染相關的HL和NHL取得一定的療效，21例患者中，13例獲得臨床響應，其中11例是完全響應。另外，樹突細胞(dendriticcell，DC)也被做為抗原提呈細胞用于制備EBV－CTL，例如，利用DC負載EBV相關的抗原多肽或者將抗原基因轉染至DC，從而提高誘導EBV－CTL的效率、縮短制備時間，以及獲得具有高度活化和殺傷活性的特異性CTL細胞[23，24]。為了提高篩選特異性CTL的效率，HLA－肽多聚體分離法和γ干擾素捕獲法目前也有臨床應用的案例[17]。但是限于需要大量外周血單個核細胞用于篩選，以及成本較為昂貴等條件限制，目前還未廣泛應用于臨床試驗。結合免疫檢測點抑制劑(immunecheckpointinhibitor)，例如抗PD－1、抗PD－L1以及抗CTLA－4抗體藥物，是否可以提高EBV－CTL在體內(nèi)的治療效果，也是未來值得關注的一個問題。

　　3．第三方CTL庫(third－partyCTL)：

　　第三方CTL庫主要是利用第三方供者來源的外周血單個核細胞，從中分離EBV特異性的CTL或者在體外進行擴增后，制備成相應的CTL細胞系，隨之用多個不同供者來源的CTL細胞系構建成CTL庫?；颊哌M行HLA配型后，選取合適的CTL細胞系進行輸注治療[21]。Haque等[25]利用第三方CTL庫開展了HLA部分相合的CTL治療移植后LPD的前期臨床試驗。Barker等[26]應用CTL庫治療了2例臍帶血移植后出現(xiàn)的LPD，2例都得到完全緩解并沒有觀察到GVHD。Leen等[27]構建抗EBV、巨細胞病毒(CMV)和腺病毒(Adv)三種病毒的CTL庫，并應用于移植后發(fā)生EBV、CMV和Adv感染的50例患者中，總有效率達到74%，其中對EBV感染的有效率為67%。在該項試驗中，研究者觀察到如供者CTL與患者之間HLA匹配程度越高，治療效果越好[27]。第三方CTL庫為治療EBV相關疾病提供了新的途徑，省卻了制備和鑒定的時間，經(jīng)過HLA匹配后可以直接用于臨床治療。但是，該方案的治療效果，尤其是安全性，例如如何選擇合適的第三方供者、HLA匹配的標準以及CTL制備和儲存流程的標準化都是未來需要進一步確認和解決的關鍵問題。

　　4．γδ－T細胞：

　　Vγ9Vδ2－T細胞具有MHC非限制性的細胞殺傷活性，且可以廣泛的識別腫瘤細胞，因此這群細胞已被積極地作為腫瘤生物治療的重要細胞而在臨床上得到廣泛應用，且已在多種晚期實體瘤的臨床試驗中顯示出了較好的安全性與療效[28]。我們在體外通過帕米膦酸二鈉(Pamidronate，一種在臨床上應用于治療骨質疏松癥的磷酸類藥物)短時間大量擴增并激活Vγ9Vδ2－T細胞，并觀察到這些細胞可以針對性的殺死被EBV轉化的自體B淋巴細胞，而不影響正常B淋巴細胞的活性。在人源化小鼠模型中，我們觀察到Pamidronate能通過特異性的擴增Vγ9Vδ2－T細胞，有效地控制LPD在體內(nèi)的發(fā)展及惡化程度。上述研究提示，注射Pamidronate以及Vγ9Vδ2－T細胞過繼輸注可作為一種治療EB病毒相關B淋巴細胞異常增殖性疾病的有效手段[29]，NEnglJMed專門撰文點評本研究與發(fā)現(xiàn)，并稱此為治療LPD提供了新的思路與途徑[30]。由于Pamidronate的安全性早已得到臨床驗證，此次“舊藥新用”為臨床醫(yī)生以及患者提供了一條現(xiàn)成以及安全有效的對抗EB病毒相關惡性疾病的策略與治療方案。同時也具備了把生物醫(yī)學研究成果，從動物模型直接轉化并應用到人類患者身上的前景。

　　四、疫苗

　　利用疫苗對EBV相關疾病進行預防和治療一直是研究的熱點。其中預防性疫苗主要是以病毒包膜糖蛋白gp350為靶點，接種后可以通過刺激機體體液免疫產(chǎn)生中和性抗體從而阻斷病毒感染宿主細胞的通路。有學者開展了以重組gp350疫苗為研究對象的小型Ⅱ期臨床研究，結果顯示該疫苗不能有效預防無癥狀的EBV感染，但是可以顯著降低接種者中IM的發(fā)生率。目前，已開始Ⅲ期臨床試驗的前期準備工作[31，32]。Rees等[33]制備出一種基于gp350的疫苗，通過Ⅰ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)可以降低無EBV過往感染史的兒童在器官移植后產(chǎn)生LPD的風險。治療性疫苗則主要是以EBV核抗原(EBNA)和LMP為靶點，刺激機體細胞免疫產(chǎn)生針對EBV相關抗原的特異性免疫應答，通過特異性CTL介導的細胞毒活性從而識別和清除表達特定靶抗原的腫瘤細胞，達到治療目的。有學者以EBV核抗原3(EBNA3)抗原表位為基礎，研發(fā)出可誘導機體產(chǎn)生特異性CD8＋T免疫應答的多肽疫苗，并進行Ⅰ期臨床試驗，結果顯示該疫苗能有效誘導機體產(chǎn)生病毒特異性CD8＋T免疫應答，從而展現(xiàn)出治療NPC等EBV相關惡性腫瘤的能力[34，35]。雖然目前關于EBV相關疫苗的研發(fā)獲得了一定的成果，但仍然有許多困難需要克服，比如除了現(xiàn)有的腫瘤標志物之外，是否還有更好的靶點？另外，如何構建和選取合適的動物模型用于檢測疫苗的臨床應用價值也是一個迫切需要解決的問題[36]。

　　五、細胞信號通路抑制劑

　　LMP2A是靜息B細胞中唯一可檢測到的EBV潛伏期基因表達產(chǎn)物，其可增強細胞周期誘導和凋亡抑制等相關基因的表達，改變DNA和RNA新陳代謝相關基因表達。約50%的EBV相關胃癌LMP2A陽性，而且LMP2A是NPC、淋巴瘤等腫瘤細胞穩(wěn)定表達的少數(shù)EBV保守抗原之一[2，37]。LMP2A可以通過調(diào)控SyK、Akt和mTOR等細胞信號通路介導B淋巴細胞的生存與增殖。因此，通過阻斷Syk、Akt等信號通路成為潛在的治療EBV相關腫瘤的重要靶點。例如，Syk的抑制劑R788(fostamatinibdisodium)和R406(freebase)等已經(jīng)在臨床前期試驗以及動物實驗中展現(xiàn)出良好的治療效果與潛力[38，39]。Akt抑制劑MK2206目前已開展臨床試驗用于檢測其治療NHL和HL的效果[2，40]。

　　隨著對于EBV感染以及EBV相關惡性疾病的發(fā)病機制的深入了解，使我們可以更加全面、透徹理解EBV與人體免疫系統(tǒng)之間的互動關系，從而為EBV相關疾病和腫瘤的預防和治療，奠定了堅實的理論和實踐基礎。

　　同時需要重視的是EBV感染后所引發(fā)的相關疾病，比如IM、CAEBV、HLH以及淋巴瘤等LPD，在疾病發(fā)展過程中它們之間可相互轉化、互為因果或同時存在。另外，EBV感染與多種人類惡性疾病發(fā)生和發(fā)展有著密切的關系，涉及的發(fā)病機制復雜，有的疾病預后極差、治療困難，所以對EBV感染相關疾病的早期診斷及隨診也很重要。

　　免疫治療尤其是細胞免疫治療，例如Vγ9Vδ2－T細胞和EBV－CTL，在前期研究或臨床試驗中已展示出對EBV相關惡性疾病的良好治療效果和應用潛力，但其安全性和有效性還需多中心大樣本的臨床隨機對照試驗進行進一步的評估和確認。另外，如何聯(lián)合目前已有的免疫治療手段，建立新的聯(lián)合治療方案，進一步提高抗腫瘤和抗病毒的治療效果，將會成為未來免疫治療發(fā)展的新趨勢。