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細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)如何減少乳酸積累？

摘要：乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶。通過(guò)下調(diào)LDH-A的含量可以有效降低細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中乳酸的積累，這點(diǎn)在眾多的文獻(xiàn)中均已得到證實(shí)。

CHO細(xì)胞是目前用于單抗的生產(chǎn)最廣泛的細(xì)胞株，用以培養(yǎng)CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素等，部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性的代謝廢物(乳酸、銨等)。銨的積累不僅會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白產(chǎn)量，還會(huì)改變蛋白的糖基化修飾；同樣，乳酸的產(chǎn)生會(huì)降低培養(yǎng)體系的pH，為調(diào)節(jié)pH而添加的堿液及高濃度的乳酸本身導(dǎo)致體系滲透壓的增加，進(jìn)而影響到細(xì)胞成長(zhǎng)和蛋白產(chǎn)量與質(zhì)量。筆者在此將促進(jìn)乳酸代謝的一些策略進(jìn)行了簡(jiǎn)單總結(jié)，可分為基因工程、添加物添加和培養(yǎng)策略改變。

LDH
 
乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶，存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶。通過(guò)下調(diào)LDH-A的含量可以有效降低細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中乳酸的積累，這點(diǎn)在眾多的文獻(xiàn)中均已得到證實(shí)。SooMinNoh等在GS篩選體系中運(yùn)用shRNA技術(shù)構(gòu)建了低表達(dá)LDH的細(xì)胞株CHO-K1LDHsi、GSKOLDHsi，與對(duì)照細(xì)胞組CHO-K1、GSKO相比，其乳酸的累積明顯降低，如圖1所示。
 
在此研究中對(duì)其他代謝參數(shù)的改變也進(jìn)行了探討，如銨的積累，基因改造細(xì)胞株也較對(duì)照組要低些，這可能要?dú)w功于GS篩選系統(tǒng)本身的優(yōu)勢(shì)。這種下調(diào)LDH表達(dá)量的技術(shù)不會(huì)影響到單抗的產(chǎn)量，Soo團(tuán)隊(duì)在對(duì)單抗的質(zhì)量屬性分析中發(fā)現(xiàn)LDH下調(diào)對(duì)糖基化具有影響，但不會(huì)影響到聚體與電荷異質(zhì)性。但其并不推薦在GS系統(tǒng)中實(shí)行下調(diào)LDH的基因工程技術(shù)，因其會(huì)影響到GS系統(tǒng)的篩選能力。還有一點(diǎn)也是值得注意的，完全的LDH基因去除對(duì)CHO細(xì)胞是致命的。
 
圖1LDH下調(diào)細(xì)胞株CHO-K1LDHsi(白色圓形)、GSKOLDHsi(白色方形)，和其對(duì)照CHO-K1(黑色圓形)、GSKO(黑色方形)的乳酸累積比較(來(lái)源于參考文獻(xiàn)1)
 
PYC2
 
丙酮酸羧化酶(pyruvatecarboxylase，PYC2)重組表達(dá)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常見(jiàn)的降低乳酸形成的策略，PYC2是糖異生循環(huán)中重要的限速酶，參與將乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油轉(zhuǎn)化生成葡萄糖的催化，因此PYC2在CHO細(xì)胞中的高表達(dá)可以加速對(duì)乳酸的消耗。
 
Toussaint等在CHO細(xì)胞中成功構(gòu)建了高表達(dá)PYC2的克隆，其團(tuán)隊(duì)將帶有PYC2基因片段的質(zhì)料pTT18嘗試導(dǎo)入129株CHO克隆，從中選取了11株P(guān)YC2-positive克隆進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。不論是檢測(cè)到的乳酸含量、體系的pH變化、又或是細(xì)胞VCD和VIA，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表明PYC2-positive組均較對(duì)照組和PYC2-nagetive組消耗了更多的乳酸。同時(shí)將這11株P(guān)YC2-positive克隆在5種常用的商業(yè)培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)，得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與對(duì)照相比其乳酸含量總是較低些。
 
Toussaint團(tuán)隊(duì)還在批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)中對(duì)PYC2-positive克隆(11號(hào)克隆)對(duì)乳酸降解的情況進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。11號(hào)克隆的peakVCD幾乎超過(guò)對(duì)照組的兩倍，后期乳酸也被消耗。值得關(guān)注的是當(dāng)使用11號(hào)克隆進(jìn)行Fed-batch實(shí)驗(yàn)時(shí)，乳酸開始消耗時(shí)葡萄糖的含量還維持在40mM，即PYC2-positive克隆對(duì)乳酸的降解不受葡萄糖濃度的限制。
 
銅離子
 
培養(yǎng)基成分始終是細(xì)胞培養(yǎng)中重要的一環(huán)，其中微量元素銅離子曾在多種CHO細(xì)胞中被證實(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及減少乳酸積累。SenXu等在ambr15微反應(yīng)器中進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，其在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了不同濃度的硫酸銅(1×?200×)，并在D4和D6分別進(jìn)行了補(bǔ)糖操作。結(jié)果見(jiàn)圖3，通過(guò)比較D4和D6補(bǔ)糖后硫酸銅實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間細(xì)胞密度與乳酸含量的變化，可知銅離子的添加可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)乳酸的消耗及細(xì)胞生長(zhǎng)。
 
究其生化層面的原因，銅離子是細(xì)胞色素c重要的輔因子，而細(xì)胞色素c參與線粒體膜上電子的傳遞過(guò)程，細(xì)胞色素c的多寡與銅離子直接相關(guān)。研究表明，線粒體氧化能力降低會(huì)造成高濃度的乳酸積累，而銅離子缺失會(huì)影響線粒體功能及代謝能力進(jìn)而擴(kuò)大乳酸生成路徑。銅離子的加入可能擴(kuò)大了線粒體的氧化容量，從而降低了乳酸的累積。另外，銅離子添加會(huì)影響到單抗的質(zhì)量，如增加堿性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。
 
葡萄糖
 
用其他代謝緩慢的糖類代替葡萄糖的策略也是降解乳酸的途徑之一，其中半乳糖是研究較多的一種。用半乳糖、巖藻糖、甘露糖和麥芽糖作為第二碳源對(duì)乳酸積累的影響見(jiàn)圖4，除甘露糖外其他糖類的添加均可降低乳酸的積累；當(dāng)以半乳糖代替葡萄糖時(shí)細(xì)胞活率出現(xiàn)快速下降，這是因?yàn)榧?xì)胞對(duì)半乳糖的降解速率緩慢，為避免這種情況可考慮將其他糖類與半乳糖共同使用。
 
低糖消耗乳酸也是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常見(jiàn)的策略。早期的一項(xiàng)研究表明，高濃度的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致高濃度的乳酸積累，限制葡萄糖及谷氨酰胺濃度后乳酸的含量也得到限制，但對(duì)于兩者的最低濃度范圍還沒(méi)有定論。Yogender等研究了30mM和10mM的葡萄糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和乳酸代謝的影響，其結(jié)果如圖5，雖然低濃度葡萄糖的細(xì)胞密度較高濃度葡萄糖低，但其乳酸含量也低些，證明低糖確實(shí)有利于乳酸降解。
 
同時(shí)，研究員還通過(guò)RNA-Seq技術(shù)對(duì)CHO細(xì)胞中的27629個(gè)基因進(jìn)行了分析，其中10090個(gè)基因在兩種不同濃度葡萄培養(yǎng)時(shí)表達(dá)，而只有575個(gè)基因表達(dá)量具有區(qū)別。更精確的分析表明，涉及糖酵解、TCA循環(huán)和糖基化的基因在兩種不同濃度葡萄糖時(shí)均沒(méi)有超過(guò)2倍的表達(dá)量區(qū)別，也就是說(shuō)控制低濃度的葡萄糖對(duì)單抗的糖基化影響不大。但有研究指出低濃度的葡萄糖會(huì)影響糖基化的位點(diǎn)，這可能也與細(xì)胞株有很大聯(lián)系。
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